CEBPAの免疫沈降

結論
　・rabbit anti-CEBPA (14AA) (Santa Cruz, sc-61)は免疫沈降に使えるが、anti-FLAG M2よりは弱い(実験1)
　・内因性CEBPAは、rabbit anti-CEBPA (14AA) IP→mouse anti-CEBPA (15C8)では検出できない(実験2A)
　・anti-mouse IgGは、rabbit IgGを検出してしまう(実験2B)

実験1
細胞：3T3-L1 (80% confluent) 6cm dish 2/3枚
トランスフェクション
　plasmid：pcDNA-FLAG-CEBPA 8/3ug + pcDNA-HA-human蛋白P 8/3ug
　lipofectamine 2000：40/3ul
　細胞回収までの時間：2日間
免疫沈降
　抗体 - コンタクト時間 - 担体
　　left panel：anti-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma, A2220), 10ul
　　right panel：rabbit anti-CEBPA (14AA) (Santa Cruz, sc-61), 1ug - 1hr - Protein G sepharose 4 Fast Flow (GE, 17-0618), 10ul
SDS-PAGE
　ローディング量：10cmディッシュ1/36枚分
　ゲル濃度：10%
ウェスタンブロット
　一次抗体：mouse anti-CEBPA (15C8) (abcam, ab15047), 1ug/ml
　二次抗体：anti-mouse IgG (GE, NA931V), 1/3000希釈
　発色液：SuperSignal West Femto
　コンタクト時間：1min



実験2
細胞：3T3-L1 (分化誘導後5日目, 分化率90%), 9cmディッシュ3/5枚
免疫沈降
　抗体
　　・rabbit IgG, 2ug
　　・rabbit anti-CEBPA (14AA) (Santa Cruz, sc-61), 2ug
　コンタクト時間：overnight
　担体：Dynabeads Proteing G (Invitrogen, 100.09D)
ローディング量：9cmディッシュ3/80枚分
ゲル濃度：10%
ウェスタンブロット
　一次抗体 - 二次抗体 - 発色液 - コンタクト時間
　　A：mouse anti-CEBPA (15C8) (abcam, ab15047), 1ug/ml - anti-mouse IgG (GE Healthcare, NA931V), 1/3000希釈 - Pierce ECL - 30min
　　B：なし - anti-mouse IgG (GE Healthcare, NA931V), 1/3000希釈 - Pierce ECL - 30min