CEBPAのクロマチン免疫沈降

実験1
　細胞：3T3-L1 (Day8, 50%分化), 6cm dish
　処理条件：DMEM(H)/FBS(-)で2回wash→10uM Pioglitazone/DMEM(H)/FBS(-), 23hr
　クロマチン免疫沈降
　　・抗体：rabbit anti-CEBPA (14AA) (Santa Cruz, sc-61, Lot D2205), 2ug
　　・DNA精製
　　　・キット：PCR-M
　　　・PX Buffer 1000ul使用
　　　・WS Bufferで2回wash
　　　・elution buffer 50ul
　　・リアルタイムPCR
　　　・mActb promoter (mouse Actb promoter -250bp付近)： GAGACATTGAATGGGGCAGT + ATGAAGAGTTTTGGCGATGG
　　　・mCat PPRE (mouse Cat promoter PPRE)： GTGCCCAGTCATACACATACACA + GGTGCCAAATGTCAAAAGCA



実験2
　細胞量(1条件あたり)
　　・3T3-L1 (分化誘導後4日目, 分化率90%), 9cmディッシュ1枚
　　・3T3-L1 (分化誘導なし, 100%コンフルエント), 9cmディッシュ1枚
　抗体量(1条件あたり)
　　・rabbit IgG, 2ug
　　・rabbit anti-CEBPA (14AA) (Santa Cruz, sc-61), 2ug
　リアルタイムPCR
　　・アニーリング温度：65℃
　　・Primer
　　　NC：mouseのintergenicなgenome領域
　　　　5'-CAGACATGTCAAATCAAGAAGACAG-3', 5'-ACTTTGGAGGAAGAGGCAGAAA-3', 増幅長91bp, Eff 90.1%
　　　Actb：mouse Actb promoter -250bp付近
　　　　5'-GAGACATTGAATGGGGCAGT-3', 5'-ATGAAGAGTTTTGGCGATGG-3', 増幅長92bp, Eff 109.0%
　　　Cebpa-CEBPRE：mouse Cebpa promoterのCEBPRE
　　　　5'-TTGCGCCACGATCTCTCTC-3', 5'-CTTAGAGCCCGCCTTCTCCT-3', 増幅長：80bp, Eff 102.7%
　　　Pparg-CEBPRE：mouse Pparg promoterのCEBPRE
　　　　5'-CCACTGGTGTGTATTTTACTGCAA-3', 5'-GTTCTGTGAGGGGCGTGAA-3', 増幅長：102bp, Eff 106.9%
　　　Fabp4-CEBPRE：mouse Fabp4 promoterのCEBPRE
　　　　5'-CATTGCCAGGGAGAACCAA-3', 5'-CCATGTGACTGTAGGAGTGACCAA-3', 増幅長：123bp, Eff 108.2%
　　　Cat：mouse Cat promoterのPPRE
　　　　5'-GTGCCCAGTCATACACATACACA-3', 5'-GGTGCCAAATGTCAAAAGCA-3', 増幅長：123bp, Eff 93.1%