Armc5とCul3の共免疫沈降　実験2

細胞
　・HEK293T
　・前日：1.5 x 10^6/10cm→培養22hr
　・当日：70% confluent
トランスフェクション
　・プラスミド：7.5ug/dish
　　・pcDNA3.1-FLAG
　　・pcDNA3.1-FLAG-mArmc5
　　・pcDNA3.1-FLAG-mArmc5ΔC
　・lipofectamine 2000：20ul/dish
　・培地交換までの時間：4hr
　・回収までの時間：29hr
蛋白調製
　・Lysis Buffer：1ml/dish
　・蛋白分解阻害剤：Proteinase Inhibitor Cocktail (Nacalai)
　・塩濃度：150mM, 250mM, 350mM
免疫沈降
　・FLAG-beads
　　・量：20ul slurry
　　・時間：2hr
　・Dynabeads
　　・anti-FLAG (Sigma, F3165, Lot: 60K9163), 1ul, 90min→Dynabeads Protein G (Thermo, 10003D, Lot: 162432120), 30ul, 2.5hr
　・洗浄：6回
　・溶出：FLAG peptide, 40ul
ウェスタンブロット
　・ゲル：10%
　・一次抗体：4℃, over night
　　・anti-FLAG M2-HRP (Sigma, A8592, Lot: 093K9158), 1/2000希釈
　　・anti-CUL3 (abcam, ab75851, Lot: GR150408-1), 1/20000希釈
　・二次抗体：anti-rabbit Ig (GE, NA934V, Lot: 17016966), 1/2000希釈