×Armc5　過剰発現　HEK293T　実験4

細胞：HEK293T (0.5 x 10^6/6cm→23hr後、70% confluent)
トランスフェクション
　・プラスミド
　　・pRK5-HA-Ub, 1.5ug/dish
　　・pcDNA3.1-FLAG-mSrebf1v1, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-mArmc5-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-mArmc5ΔC-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-hARMC5v1-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-hARMC5v1(C943T)-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-hARMC5v1(T992C)-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-hARMC5v1(G1085T)-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-hARMC5v1(T2261C)-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-hARMC5v1(C2692T)-myc-His, 0.75ug/dish
　・lipofectamine 2000：8ul/dish
　・Opti-MEM：560ul/dish
Lysis：トランスフェクション46hr後、ユビキチンアッセイ用Lysis Buffer (20mM Tris) 200ul→95℃, 10min→sonication, 10回→4 x sample buffer添加→95℃, 5min
ウェスタンブロット
　・ゲル：7.5-10%
　・一次抗体
　　・anti-FLAG M2-HRP (Sigma, A8592, 093K9158), 1/2000希釈, R.T., 75min
　　・Myc-tag (9B11) mAb (HRP conjugate) (Cell Signaling, 2040, 6), 1/1000希釈, 4℃, over night
　　・anti-ACTB (Sigma), 1/3000希釈, 4℃, over night
　・二次抗体：anti-mouse Ig (NA931V, 17212127), 1/2000希釈, R.T., 90min