〇細胞内コレステロール測定 6 well plate
Cholesterol/Cholesteryl Ester Assay Kit (abcam, ab65359)を使用
1. 培地を吸引し、PBS 2mlを加える。
2. PBSを吸引し、PBS 2mlを加える。
3. PBSを吸引し、PBS 500ulを加え、細胞をセルスクレイパーで1.5mlチューブに回収し、on ice。
4. 400g, 4℃, 5min遠心し、上清を除き、PBS 500ulを加え、タッピング。
5. 400g, 4℃, 5min遠心し、上清を除く(-80℃に保存可)。
6. クロロホルム/イソプロパノール/NP40 200ulを加え、Output 3でsonication 10回。
7. 12000g, 24℃, 10min遠心し、上清を回収する。
8. Genevac EZ-2 Plusを予約し、移動する。
9. 電源ON→LID→アダプターとサンプルをセット→蓋を閉める→SET MAX Tempを50℃に設定。
10. Selectダイヤルを回し、Low BP→Time to Final Stageを30minに変更→Final Stage
Timeを0minに変更→Start。
11. 終了したら、廃液を捨て、使用記録簿を記載し、サンプルを回収する。
12. Cholesterol Assay Bufferを溶かし、200ulを加え、vortex (-30℃に保存可)。
13. 25ng/ul Cholesterol Standardを調製する。
14. 96well black plate (Thermo, 237105)にCholesterol Assay Bufferを50ul, 46ul, 42ul, 38ul, 34ul, 30ul加える。
15. 25ng/ul Cholesterol Standardを0, 4, 8, 12, 16, 20ul加え、0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5ug/wellとする。
16. サンプル希釈用に、Cholesterol Assay Bufferを、2ウェルずつ加える。
17. サンプルを加える。
18. 次の試薬を混ぜる。
19. StandardとTotal Cholesterol用サンプルに対し、Cholesterol Esterase 2ulを加え、Free Cholesterol用サンプルに対し、Cholesterol Assay Buffer 2ulを加える。
20. 混合液を50ul加え、タッピングし、アルミホイルでくるみ、37℃, 45-60min。
21. SH-9000Labを用い、励起535nm/測定590nmで測定