×CRISPR-Cas9　ソーティング　受託する場合

1. 共同研予約システムで、1週間後以降のSH800ZDPを12-17時に予約する。
2. ソーティング受託業務オンライン受付を行う。
　・レーザー：488nm
　・ノズル：100um
　・抗体・蛍光色素の種類：EGFP
　・蛍光の数：1
3. transfectionした細胞とtransfectionしていない細胞を、2.5% FBS/HBSSを用い、5x10^6/mlに懸濁し、on ice。
4. 13時に、以下を持参する。
　・細胞懸濁液
　・10mlメディウム入り15mlチューブ
　・空の15mlチューブ 複数本
　・5ml tube with cell-strainer cap (Falcon, 352235)
　・5ml tube (Falcon, 352058) 1本
　・廃液タンク
　・USB
　・プリントしたPDFファイル
　・説明書
　・P1000ピペットマンとチップ
5. 超純水のボトルのコネクターを外す→フィルターを抜く→超純水を交換。
6. コンプレッサーをON→0.5MPaになったら、本体をON→パソコン、キーボード、マウスをON→パスワードfcmでログイン
7. CellSorter Softwareを起動→ID：endmet、Pwd：endmet3743を入力。
8. チップを読み取る→チップを交換→日付、時間を書き、机に置いておく。
9. 488nm→without 405nm
10. automatic setup beads (LE-B3001)を良く撹拌し、5mlチューブに10滴滴下し、アダプターにセット→standard→OK
11. FL1をEGFPに変更→使用しないチャネルのAreaのチェックを外す。
12. Create New Experiment→Detector & Therdule Settings
13. negative controlをフィルターし、load→Start
14. ダブルクリックしながら枠を決める。
15. Event countをgated event countに変更→stop valueを設定→record
16. 終了したら、stop→next tube→メディウム入り15mlチューブをアダプターの左にセット
17. ModeをPurityに変更→To sortの左をCに変更→Stop countを変更
18. Cytometer→Collection 5℃→Sample 5℃
19. Load Collection→Start→event rateが約1500epsであることを確認。
20. Dropletが緑になっているのを確認→Auto Recordにチェック→Sort Start
21. サンプルが無くなる前に、Sort Stop→Stop
22. File→Print
23. Cytometer→Software and hardware→start
24. 30mlチューブにハイター希釈液25mlを加え、セット→Careful cleaning→start
25. 15mlチューブに超純水12mlを加え、セット→Next→normal cleaning→start→next
26. PCをシャットダウン→キーボード、マウスをoff。
27. 手袋をし、偏光板(細い方が上) 2枚、アスピレーターを外し、超純水で濡らしたプロワイプで拭き、空拭きする。
28. 庫内を超純水で塗らしたプロワイプで拭き、空拭きする。
29. コンプレッサーをoff→ベントバルブを引っ張ってairを抜き、connectorを外す→シース液を線まで補充→廃液を回収する。
30. 予約の残りをキャンセルする。
31. 1200rpm, 24℃, 10minで遠心し、上清を除き、ディッシュにまく。