×CRISPR-Cas9　ソーティング　受託しない場合

1. 共同研予約システムで、SH800ZDPを予約する。
2. 共同研事務室で、100um Sorting Chip (SONY, LE-C3210)をもらう。
3. automatic setup beads (LE-B3001)を良く撹拌し、5mlチューブ(Falcon, 352058)に10滴滴下する。
4. 以下を持参して、6階のSH800ZDPに移動する。
　・100um Sorting Chip
　・automatic setup beads
　・フラッシュメモリ
5. シースタンクの蓋が閉まっているのを確認する。
6. 側面を開け、留め金を押し、DIウォータータンクのコネクターを外す→超純水を交換→コネクターをカチッと鳴るまで取り付ける。
7. コンプレッサーをON→0.5MPaになったら、Power/Standbyを押す→パソコン、キーボード、マウスをON→パスワードfcmでログイン
8. CellSorter Softwareを起動→ID：endmet、Pwd：endmet3743を入力。
9. チップを読み取る→Next→フラップドアを開ける→チップを交換→フラップドアを閉じる→パッケージに日付、時間を書き、机に置く→Next
10. 488nm→Next→without 405nm laser→Next
11. automatic setup beadsを良く撹拌し、チューブホルダーにセット→サンプルローダーにセット→Start→standard→OK
12. Nameを記入→FL1をEGFPに変更→使用しないチャネルのAreaのチェックを外す→Create New Experiment
13. Gate AをTo Polygonで変更→ダブルクリック→横軸をFSC-H、縦軸をFSC-Wに変更
14. PolygonでGate Bを作成し、ダブルクリック→横軸を蛍光、縦軸をEventsに変更→Linearで範囲を決定
15. negative controlのH295RをTrypsin/EDTA処理し、2.5% FBS/HBSSを加え、1000rpm, 5min遠心
16. 2.5% FBS/HBSS 500ul-1mlを加え、圧力ピペッティング4回し、細胞数をカウントし、フィルター付き5mlチューブに加え、on ice。
17. FACSにセット→Start
18. Cytometer→Temperature Control→Collection 5℃→Sample 5℃
19. event rateが1500以下であることを確認→Record→Stop
20. Tube-1を右クリック→Duplicate→Assign tube
21. 目的のH295Rをharvest→15mlチューブにメディウム9mlを加える→H295RをFACSにセット

15. Event countをgated event countに変更→stop valueを設定→record
16. 終了したら、stop→next tube→メディウム入り15mlチューブをアダプターの左にセット
17. ModeをPurityに変更→To sortの左をCに変更→Stop countを変更
19. Load Collection→Start→event rateが約1500epsであることを確認。
20. Dropletが緑になっているのを確認→Auto Recordにチェック→Sort Start
21. サンプルが無くなる前に、Sort Stop→Stop
22. File→Print
24. 新しい30mlチューブにハイター希釈液25mlを加え、セット→Cytometer→Shutdown→Software and hardware→start→Careful cleaning→start
25. 15mlチューブに超純水12mlを加え、セット→Next→normal cleaning→start→next
26. PCをシャットダウン→キーボード、マウスをoff。
27. 手袋をし、偏光板(細い方が上) 2枚、廃液キャッチャーを外し、超純水で濡らしたプロワイプで拭き、空拭きする。
28. 庫内を超純水で塗らしたプロワイプで拭き、空拭きする。
29. コンプレッサーをoff→ベントバルブを引っ張ってairを抜き、connectorを外す→シース液を線まで補充→廃液を回収する。
30. 予約の残りをキャンセルする。
31. 1200rpm, 24℃, 10minで遠心し、上清を除き、ディッシュにまく。

VersaComp Antibody Capture Beadを用いたテスト