×Cul3　ノックダウン　HEK293T

細胞：HEK293T (0.6 x 10^6/10cm→30hr後、60% confluent)
siRNA transfection
　・siRNA：180pmol/dish
　　・Silencer Select Negative Control No.1
　　・siCUL3 #1：siCUL3 (Ambion, s16050)
　　・siCUL3 #2：siCUL3 (Ambion, s531239)
　・Lipofectamine RNAiMAX：30ul/dish
　・培養：培地交換なし→18hr後、1/7量を6cm dishに継代
plasmid transfection
　・プラスミド
　　・pRK5-HA-Ub, 1.5ug/dish
　　・pcDNA3.1-FLAG-mSrebf1v1, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-myc-His, 0.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-hARMC5-myc-His, 0.75ug/dish
　・Lipofectamine 2000：8ul/dish
　・培養：5hr後、培地交換
蛋白回収：トランスフェクション27hr後、ユビキチンアッセイ用Lysis Buffer (10mM Tris), 200ul→95℃, 10min→sonication, 10回→4 x sample buffer添加→95℃, 5min
ウェスタンブロット
　・一次抗体：4℃, over night
　　・anti-FLAG-HRP (Sigma, A8592, 093K9158), 1/2000希釈
　　・anti-Myc-HRP (Cell Signaling, 2040, 6), 1/1000希釈
　　・anti-CUL3 (abcam, ab75851, GR150408-1), 1/20000希釈
　・二次抗体：anti-rabbit Ig (NA934V, 17348043), 1/2000希釈, R.T., 90min