〇EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, 12362)

1. プラスミドをtransformationする。
2. 300 or 500ml三角フラスコでLB(抗生物質+) 100mlを作成(複数ある場合はまとめて作り、分注する)。
3. 恒温振盪培養器を予約する。
4. ピンセットをエタノールに浸して持ち上げ、ライターで火をつけて消毒し、オートクレーブ済み爪楊枝(あるいはピペットマンチップ)でLBプレートの大腸菌コロニーをピックアップし、LB(Amp+)に爪楊枝(チップ)ごと落とす。
5. shakerに入れて120rpm, 37℃し、増えるまで待つ(12-20hr位。培養時間が長すぎると収量が激減する事がある)(明らかに増殖が悪い時は常在菌のコンタミを疑う)(室温で数時間、4℃で数日保存可)。
6. 一部(40ml以下)を50mlチューブにデカントし、遠心9000g, 5minし、上清をデカントで捨てる
7. 操作5を繰り返し、全ての大腸菌を回収する(-30℃に保存可)
8. Buffer P3を冷蔵庫に入れておく。
9. Buffer P1 10mlを加え、vortexする
10. Buffer P2 10mlを加え、6回転倒混和し、5min静置
11. 冷却したBuffer P3 10mlを加え、溶液の青色が消えるまで転倒混和し、遠心2150-6000g, 24℃, 3min
12. QIAfilter Cartridgeにキャップを取り付け、Lysateを注ぎ、50mlチューブに濾過する(20mlシリンジと0.2um/0.45umフィルターでも可)。
13. Buffer ER 2.5mlを加え、10回転倒混和し、on iceで30minインキュベート。
14. QIAGEN-tip 500にBuffer QBT 10mlを加え、自然落下させる(間違ってBuffer QNを使用しても、特に問題はない)。
15. Lysateをカラムに加え、自然落下させる(カラムの先端が下受けに接しないよう注意)。
16. Buffer QCをカラム一杯まで加え、自然落下させる
17. Buffer QCをカラム一杯まで加え、自然落下させる。
18. カラムを50mlチューブにセットし、Buffer QN 15mlを加え、自然落下させる(4℃, over nightで保存可)。
19. イソプロパノール(ナカライ, 29113-95)10.5mlを加え、vortexし、9000g, 4℃, 30minで遠心
20. 上清をデカントで除き、endotoxin-free 70%EtOHで共洗いしながらペレットを1.5mlチューブに移す
21. 遠心12000g, 4℃, 3-5minして上清を捨て、スピンダウンし、残った上清をピペットマンで除き切る
22. endotoxin-free 70%EtOH 500ulを加える(4℃で保存可)
23. 遠心12000g, 4℃, 3-5minし、上清を捨て、スピンダウンし、残った上清をピペットマンで除き切る
24. endotoxin-free 70%EtOH 500ulを加える(4℃で保存可)
25. 遠心12000g, 4℃, 3-5minし、上清を捨て、スピンダウンし、残った上清をピペットマンで除き切る
26. キムワイプを被せて風乾10-30minし、Buffer TE 100-500ulを加え、室温, over nightで溶かす。
27. 遠心12000g, 4℃, 5minし、上清をBuffer TEで希釈し、濃度調整する。