肝臓の中性脂肪含量測定　有機溶媒を用いる方法

1. 凍結した肝臓33-66mgを量り取り、重量を記録し、1.5mlチューブに入れ、液体窒素に浸ける(-80℃に保存可)。
2. 13mlアシストチューブに移し、Lysis溶液を60ul/mg tissue加え、ポリトロンで破砕する。サンプル毎に水とLysis溶液でポリトロンを共洗いし、Lysis溶液はサンプル2本毎に新しくする。
3. Lysis溶液を40ul/mg tissue足す。
4. 15mlチューブに3mlを分注する。
5. 50mM NaCl 750ulを加え、vortexし、遠心1500g, 10min。
6. 下層(約2ml)のうち1.5mlを15mlチューブに移し、0.36M CaCl2/methanol 750ulを加え、vortexし、遠心1500g, 10min。
7. 下層1mlを1.5mlチューブに移し、0.36M CaCl2/methanol 500ulを加え、vortexし、遠心1500g, R.T., 10min。
8. 下層750ulを1.5mlチューブに移す。
9. 100ulを分注し、50% TritonX/chloroform 100ulを加え、over nightで濃縮遠心。
10. 2-プロパノール(nacalai, 29113-95) 40ulを加える。
11. トリグリセライド E-テストワコー(Wako, 432-40201))を用意する。
12. 発色試液を調製する。
13. 基準液(Wako, 433-40231)をMilliQで1/3希釈、2/3希釈し、それぞれ100mg/dl、200mg/dlとする。
14. 96wellプレート(Iwaki, 3860-096)にMilliQ、100mg/dl、200mg/dl、基準液を2ul(300mg/dl)、基準液を4ul(596.1mg/dl)加える。
15. サンプル2ulを加える。
16. 発色試液300ulを加え、37℃, 5minインキュベート。
17. O.D. 600nmとO.D. 700nmを測定し、差を算出する。
18. 検量線から中性脂肪濃度を算出する(mg/dl)。

希釈直線性