〇NucleoBond Xtra Midi EF

1. プラスミドをtransformationする。
2. 200 or 300ml三角フラスコでLB(抗生物質+) 70-80mlを作成(複数ある場合はまとめて作り、分注する)。
3. 恒温振盪培養器を予約する。
4. ピンセットをエタノールに浸して持ち上げ、ライターで火をつけて消毒し、オートクレーブ済み爪楊枝でLBプレートの大腸菌コロニーをピックアップし、LB(抗生物質+)に入れる。
5. shakerに入れて120rpm, 37℃し、12-20hr。
6. 一部(40ml以下)を50mlチューブにデカントし、遠心9000g, 5minし、上清をデカントで捨てる。
7. 操作6を繰り返し、全ての大腸菌を回収し、0.75g以下であることを確認する(-30℃に保存可)。
8. 氷を準備する
9. RES-EF (RNase+) 8mlを加え、vortex。
10. Nucleobond Xtra ColumnをQIArackにセットし、EQU-EF 15mlを回しかける。
11. サンプルにLYS-EF 8mlを加え、転倒混和5回し、5min。
12. NEU-EF 8mlを加え、透明になるまで転倒混和し、on ice, 5min。
13. 3回転倒混和し、カラムに注ぐ。
14. FIL-EF 5mlをフィルターに回しかける。
15. フィルターを除く。
16. ENDO-EF 35mlを加える。
17. WASH-EF 15mlを加える。
18. Plastic Washerを用いてカラムを50mlチューブに固定し、ELU-EF 5mlを加える。
19. カラムを外し、イソプロパノール3.5mlを加え、vortexし、9000g, 4℃, 30min遠心。
20. 上清をデカントで除き、endotoxin-free 70% EtOHで共洗いしながらペレットを1.5mlチューブに移す。
21. 12000g, 4℃, 5min遠心し、上清を捨て、スピンダウンし、残った上清をピペットマンで除ききり、endotoxin-free 70% EtOH 500ulを加える(4℃で保存可)。
22. 12000g, 4℃, 3min遠心し、上清を捨て、スピンダウンし、残った上清をピペットマンで除ききる。
23. endotoxin-free 70% EtOH 500ulを加え、12000g, 4℃, 3min遠心し、上清を捨て、スピンダウンし、残った上清をピペットマンで除ききる。
24. キムワイプを被せて風乾10-30minし、TE-EF 100-500ulを加え、室温, over nightで溶かす。
25. 濃度を測定し、TE-EFで濃度調整する。