ゲノムからプロモーターをクローニングし、レポータープラスミドに入れる

1. 取得したいプロモーターの範囲を決定する。3'末端は、exon 1の5'末端〜翻訳開始点のATG、の間に設定する。
2. プラスミドのmulti cloning siteの内、プロモーター配列に存在しない制限酵素を2つ選択する。候補が複数ある場合は、突出塩基数が多く、double digestionし易い2つを選択する。
3. 取得したいプロモーターが含まれるようにプライマーを設計し、制限酵素配列、A6個を付加してプラ イマーを設計する。
例) NotI配列を付加する場合：AAAAAAGCGGCCGC[相同配列]
4. Word上に、完成したプラスミドの配列を再現し、exon 1の5'末端から数えて初めてのATGがLuciferase遺伝子のATG (ATGGAAGACGCC)である事を確認できたら、プライマーを注文する。
5. ゲノム40ngをテンプレートとし、アニール温度65℃/サイクル数35/液量50ulでPCRをかけ、電気泳動で増幅を確認する。

実施例