蛋白Pの強制発現

結論
　・蛋白Pは過剰発現可能

実験1：3T3-L1 adipocyteへの過剰発現

細胞：3T3-L1 adipocyte (Day3, 80%分化), 10cm dish 2枚
トランスフェクション
　plasmid：pcDNA-FLAG-HA-human蛋白P 48ug
　lipofectamine 2000：120ul
　細胞回収までの時間：46hr
SDS-PAGE
　ローディング量
　　A：10cmディッシュ1/300枚分
　　B：10cmディッシュ1/9枚分
免疫沈降
　ビーズ：Anti-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma, A2220), 40ul
　溶出：Flag peptide
ウェスタンブロット
　一次抗体：rabbit anti-FLAG (Sigma, F7425), 1/1000希釈
　二次抗体：anti rabbit Ig (Dako, P0448), 1/3000希釈
　発色液：Pierce ECL
　コンタクト時間：30min


実験2：HEK293Tへの過剰発現

細胞：HEK293T (70% confluent), 10cm dish 1枚
トランスフェクション
　plasmid：pcDNA3.1-FLAG-HA-hProtein P, 24ug
　lipofectamine 2000：60ul
　細胞回収までの時間：49hr
　細胞のviability：明らかな細胞浮遊、細胞死、増殖抑制を認めた
免疫沈降
　ビーズ：Anti-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma, A2220), 20ul
　溶出：sample buffer
SDS-PAGE
　ローディング量：左から10cm dish 1/60枚分、1/600枚分、1/1800枚分、1/6000枚分
ウェスタンブロット
　一次抗体：rabbit anti-hProtein P, 0.44ug/ml
　二次抗体：anti rabbit Ig (Dako, P0448), 1/3000希釈
　発色液：Pierce ECL
　コンタクト時間：1min