〇リアルタイムPCR用プライマー設計　Primer-BLASTを使用

1. バリアントがある場合は、Clustal Wで共通配列を同定する。
2. Primer-BLASTに移動する。
3. Reset Page→PCR TemplateにAccession No.を入力→Rangeの、「Forward primerのFrom」と「Reverse primerのTo」に、共通配列の範囲を指定。
4. PCR product sizeをMin 80、Max 150に設定。
5. Primer melting temperatures (Tm)をMin 60、Opt 62、Max 65、Max Tm difference 4に設定。
6. Exon junction spanをPrimer must span an exon-exon junctionに設定。
7. Specificity checkを外す。
8. Advanced parameters→Primer SizeをMin 17に設定。
9. Primer GC contentをMin 40、Max 60に設定。
10. GC clampを1に設定。
11. Max Poly-Xを4に設定。
12. Show results in a new windowにチェック→Get Primers