〇細胞内コレステロール測定 12 well plate
Cholesterol/Cholesteryl Ester Assay Kit (abcam, ab65359)を使用
1. 遠心機を4℃にしておく。
2. 培地を吸引し、PBS 1mlを加える。
3. PBSを吸引し、PBS 1mlを加える。
4. PBSを吸引し、PBS 250ulを加える。
5. 細胞をセルスクレイパーで1.5mlチューブに回収し、on ice。
6. 400g, 4℃, 5min遠心し、上清を除き、PBS 500ulを加え、タッピングし、RNA抽出用に250ulを1.5mlチューブに分注する。
7. 400g, 4℃, 5min遠心し、上清を除く(-80℃に保存可)。
8. クロロホルム/イソプロパノール/NP40 200ulを加え、Output 3, Duty Cycle 20%でsonication 10回。
9. 12000g, 24℃, 10min遠心し、上清を回収する。
10. Genevac EZ-2 Plusを予約し、9Fに移動する。
11. 電源ON→LID→アダプターとサンプルをセット→蓋を閉める→SET MAX Tempを50℃に設定。
12. Selectダイヤルを回し、Low BP→Time to Final Stageを30minに変更→Final Stage
Timeを0minに変更→Start。
13. 終了したら、廃液を捨て、使用記録簿を記載し、サンプルを回収する。
14. Cholesterol Assay Bufferを溶かし、200ulを加え、vortex (-30℃に保存可)。
15. 25ng/ul Cholesterol Standardを調製する。
16. 96well black plate (Thermo, 237105)にCholesterol Assay Bufferを50ul, 46ul, 42ul, 38ul, 34ul, 30ul加える。
17. 25ng/ul Cholesterol Standardを0, 4, 8, 12, 16, 20ul加え、0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5ug/wellとする。
Total Cholesterolを測定する場合
18. plateに、サンプル希釈用にCholesterol Assay Bufferを、(50-X)ul加える。
19. サンプルXulを加える。
20. 1ウェル当たり、次の試薬を混ぜる。
21. 混合液を加え、タッピングし、アルミホイルでくるみ、37℃, 45-60min。
22. SH-9000Labを用い、励起535nm/測定590nmで測定