×細胞周期測定　10cmディッシュ

1. 遠心機を4℃にしておく。
2. H295RをTrypsin/EDTA処理し、15mlチューブに回収する。
3. PBS 5mlを加え、遠心し、上清を除く。
4. PBS 1mlを加え、圧力ピペッティングする。
5. 70%エタノール 9mlにゆっくり滴下し、on ice 30min以上(4℃で2年間保存可)。
6. 200g, 4℃, 10min遠心し、上清を除き、ペレットをタッピングし、PBS 3mlを加える。
7. 200g, 4℃, 10min遠心し、上清を除き、ペレットをタッピングし、PBS 3mlを加える。
8. 200g, 4℃, 10min遠心し、上清を除き、ペレットをタッピングし、PI染色液 500ulを加え、1.5mlチューブに移す。
9. 37℃, 15minインキュベートし、on ice (4℃で2週間保存可)。
10. 9階のSH800ZDPに移動し、100um Sorting Chip (SONY, LE-C3210)が前回使用から24時間以上経過していれば、共同研事務室で新しいチップをもらう。
11. automatic setup beads (LE-B3001)を良く撹拌し、5mlチューブ(Falcon, 352058)に10滴滴下する。
12. 100um Sorting Chip、automatic setup beads、手袋を持参し、SH800ZDPに移動する。
13. シースタンクの蓋が閉まっているのを確認する。
14. 側面を開け、留め金を押し、DIウォータータンクのコネクターを外す→超純水を交換→コネクターをカチッと鳴るまで取り付ける。
15. コンプレッサーをON→0.5MPaになったら、Power/Standbyを押す→パソコン、キーボード、マウスをON→パスワードfcmでログイン
16. CellSorter Softwareを起動→ID：endmet、Pwd：endmet3743を入力。
17. チップを読み取る→Next→フラップドアを開ける→チップを交換→フラップドアを閉じる→パッケージに日付、時間を書き、机に置く→Next
18. 488nm→Next→without 405nm laser→Next
19. automatic setup beadsを良く撹拌し、チューブホルダーにセット→サンプルローダーにセット→Start→standard→OK
20. サンプルを、セルストレーナー付き5mlチューブ(Falcon, 352235)に移す。
21. サンプルとフラッシュメモリを持参し、SH800ZDPに移動する。
22. Nameを記入→FL3をPIに設定→使用しないチャネルのAreaのチェックを外す→Create New Experiment
23. Gate AをTo Polygonで変更→ダブルクリック→グラフAの横軸をFSC-H、縦軸をFSC-Wに変更
24. PolygonでGate Bを作成し、ダブルクリック→グラフBの横軸をPI-A-Compensated、縦軸をEventsに変更
25. サンプルをFACSにセット→Start
26. event rateが1500以下であることを確認→Record→Stop
27. Tube-1を右クリック→Duplicate→Assign tube
28. File→Print
29. File→Database→Export
30. Tubeを右クリック→Export FCS File→FCS Version 3.1
31. 新しい30mlチューブにハイター希釈液25mlを加え、セット→Cytometer→Shutdown→Software and hardware→start→Careful cleaning→start
32. 15mlチューブに超純水12mlを加え、セット→Next→normal cleaning→start→next
33. PCをシャットダウン→キーボード、マウスをoff。
34. 手袋をし、偏光板(細い方が上) 2枚、廃液キャッチャーを外し、超純水で濡らしたプロワイプで拭き、空拭きする。
35. 庫内を超純水で塗らしたプロワイプで拭き、空拭きする。
36. コンプレッサーをoff→ベントバルブを引っ張ってairを抜き、connectorを外す→シース液を線まで補充→廃液を回収する。
37. 使用記録簿に記入する。
38. 予約の残りをキャンセルする。
39. 6Fデータ解析室に移動し、USB延長コードにフラッシュメモリを差し込み、FCSファイルを移す。
40. FlowJo v10.8.1を起動→FCSファイルをドラッグ
41. 必要に応じて軸のTマークをクリック→Customize Axis
42. ゲートをかけ、ダブルクリック
43. ゲート名を選択→Biology→Cell Cycle→X軸をPI-A
44. Layout Editor→ゲート名をドラッグ→PDF→Create Batch Report→PDFを保存
45. File→Save As→Save as Archive
46. 使用記録を記入