siRNA導入　electroporation　複数サンプル　2ウェル/サンプル

1. ピペットマンとチップをUVで30min以上滅菌。
2. Nucleofector IをT20に設定しておく。
3. 100uM siRNAをon iceにしておく。
4. キュベットにラベルし、駒込ピペットを準備しておく。
5. Nucleofector Solutionを調製し、室温に置いておく。
6. Collagen-coated 24well (Iwaki, 4820-010)を準備しておく。
7. 15mlチューブにメディウムを1.6mlずつ加えておく。
8. 50mlチューブに、harvest用のメディウムを分注しておく。
9. H295R 10cm 4枚にトリプシン/EDTA 1mlを加え、メディウム3mlで中和し、50mlチューブ2本に回収する。
10. ピペットを底に付けてピペッティング5回し、50mlチューブに合わせ、細胞数を数える。
11. 5x10^6ずつ15mlチューブ4本に分注し、130g, 5minで遠心し、上清を除く。
12. Nucleofector Solution 100ulを加え、ピペッティング30-40回。
13. 100uM siRNA 4ulを加え、キュベットに移し、蓋をする。
14. Nucleofector Iにキュベットを挿入し、パルスをかけ、メディウム500ulを加え、駒込ピペットでメディウムの入った15mlチューブに移す。
15. 手順12-14を繰り返す。
16.. 1mlずつ、24ウェルに移す。