Srebf1　ユビキチンアッセイ　実験3

細胞：HEK293T (10cm)
　・密度：1.6 x 10^6/dish→18hr後、80% confluent
トランスフェクション
　・プラスミド
　　・pRK5-HA-Ubiquitin WT, 3.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-FLAG-mArmc5, 1.875ug/dish
　　・pcDNA3.1-FLAG-mSrebf1, 1.875ug/dish
　　・pcDNA3.1-myc-His, 1.875ug/dish
　　・pcDNA3.1-mArmc5-myc-His, 1.875ug/dish
　・lipofectamine 2000：20ul
　・時間：4hr
処理：トランスフェクション24hr後から、10uM MG132, 5hr
Lysis：400ul, 95℃, 10min, sonication 10回
免疫沈降
　・Buffer
　　・Triton-X (+), 9倍希釈
　　・Triton-X (-), 5倍希釈
ウェスタンブロッティング
　・ゲル：7.5%
　・一次抗体：4℃, over night
　　・anti-HA (262K) (Cell Signaling, 2362, 4), 1/1000希釈
　　・anti-FLAG M2-HRP (Sigma, A8592, 093K9158), 1/2000希釈
　　・Myc-tag (9B11) mAb (HRP conjugate) (Cell Signaling, 2040, 4), 1/1000希釈
　・二次抗体：anti-mouse Ig (GE, NA931V, 17041904), 1/2000希釈