Srebf1　ユビキチンアッセイ　実験4

細胞：HEK293T (10cm)
　・密度：1.5 x 10^6/dish→23hr後、90% confluent
トランスフェクション
　・プラスミド
　　・pRK5-HA-Ubiquitin WT, 3.75ug/dish
　　・pcDNA3.1-FLAG-mArmc5, 1.875ug/dish
　　・pcDNA3.1-FLAG-mSrebf1, 1.875ug/dish
　　・pcDNA3.1-myc-His, 1.875ug/dish
　　・pcDNA3.1-mArmc5-myc-His, 1.875ug/dish
　・lipofectamine 2000：20ul
　・時間：5hr
処理：トランスフェクション24hr後から、10uM MG132 6hr
Lysis：400ul, 95℃ 10min, sonication 10回
免疫沈降：90min
ウェスタンブロッティング
　・ゲル：7.5%
　・一次抗体：4℃, over night
　　・anti-HA (C29F4) (Cell Signaling, 3724, 9), 1/5000希釈
　　・anti-FLAG M2-HRP (Sigma, A8592, 093K9158), 1/2000希釈
　　・Myc-tag (9B11) mAb (HRP conjugate) (Cell Signaling, 2040, 4), 1/1000希釈
　・二次抗体：anti-rabbit Ig (GE, NA934V, 17089344), 1/2000希釈