上清中8-isoprostane測定

8-Isoprostane EIA Kit (Cayman, 516351)を使用する場合

1. 細胞の上清1mlを回収し、5mg/ml BHT 10ulを加える(-80℃に保存可)。

抽出する場合
2. 全てのサンプルから一部を分注して一旦合わせ、600ul x 2本に分注する。
3. 一方にのみ5ng/ml 8-isoprostane 24ulを加える。
4. サンプルを600ul分注する。
5. サンプル、手順2, 3で分注したミックスに30%酢酸 300ulを加える。
6. Sep-Pak Vac 3cc (Waters, WAT054945)にメタノール(nacalai, 21915-93) 3mlを加える。
7. 乾燥しない内にMilliQ 3mlを加える。
8. サンプルを加える。
9. MilliQ 3mlを加える。
10. ヘキサン(nacalai, 17929-11) 3mlを加え、2.5mlシリンジ(Terumo, ss-02Sz)で押しだす。
11. ドラフトに入れ、風乾60min。
12. 15mlチューブにカラムをセットし、酢酸エチル/1%メタノール 3mlを加える。
13. 濃縮遠心機, over nightで溶媒を蒸発させる。
14. EIA Buffer 500ul〜1mlを加え、vortex。

抽出しない場合
2. 5ng/ml 8-isoprostaneをEIA Bufferで希釈し、500, 500/3, 500/9, 500/27, 500/81, 500/243, 0pg/mlに調製する。
3. プレートにstripをセットし、stripをナンバリングする。
4. 1well (NSB well)にEIA Buffer 100ulを加える。
5. standard 50ulをwellに加える。
6. サンプルを12000g, 4℃, 2minし、上清50ulをwellに加える。
7. 8-Isoprostane AchE Tracer 50ulを加える。
8. NSB well以外に8-Isoprostane EIA Antiserum 50ulを加え、タッピングし、シールをして4℃, over night
9. Ellman's Reagentを調製する。
10. Wash Buffer 300ulで5回washする。
11. Ellman's Reagent 200ulを加え、遮光し、R.T., 80min
12. O.D. 405nmで測定する。