組織GSH/GSSG測定

※手順4のサンプルでは蛋白定量、DNA定量共に値が出ない。

GSSG/GSH Quantification Kit (Dojindo, G257)を使用する場合

1. 凍結した組織を氷上で30-40mg測り取り、重量を記録し、1.5mlチューブに入れ、液体窒素に浸ける。
2. 氷上で5% SSAを5ul/mg加え、sonication。
3. 8000g, 4℃, 10minで遠心し、中間層30ulを採取する。
4. MilliQ 270ulを加える(-30℃に保存可)。
5. 200uM GSH standard solution 50ulを0.5% SSAで50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0uMに希釈する。
6. Substrate working solution 20ulを加える(沈殿が溶けている事を確認する)。
7. Coenzyme working solution 20ulを加える。
8. Enzyme working solution 20ulを加え、マルチチャネルでピペッティングする。
9. 37℃, 10minし、O.D. 405nmを測定。
10. 一次直線で検量線を引き、手順4の濃度を算出する(uM)。
11. 10を掛け算し、手順3の濃度を算出する(uM)。
12. 5を掛け算し、単位重量当たりの量を算出する(pmol/mg)。