〇ルシフェラーゼアッセイ
Dual-Luciferase Reporter
Assay System (Promega, E1910)を使用
12wellの場合
1. Passive Lysis Bufferを調製する。
2. PBS 1mlでwashする(コラーゲンコートディッシュのHEK293Tはアスピレート可能)(-80℃に保存可)。
3. Passive Lysis Buffer 250ulを加える。
4. Orbital shakerで15分以上 or Taiyo Micro Mixer (TAITEC), 強度5で5分以上。
5. (必要に応じて) 200ulを1.5mlチューブに移し、-30℃に保存する。
6. (必要に応じて) 12000g, 4℃, 1min遠心し、上清を回収する(-30℃に保存可)。
7. ルミノメータを予約する。
8. Firefly Luciferase試薬、Renilla Luciferase試薬を室温に戻す。
9. 白色96wellプレート(Costar) or Black Plate (Thermo, 237105)にサンプル40ulを分注
Centro XS3 LB960を使用する場合
10. USBを持参し、共同研2FのCentro XS3 LB960へ移動→電源をON→パソコンの電源をON
11. Para Centroへのショートカット→DLR 50ul 1sec.parを開く
12. Settings→Measurementタブ→中央列の上のDispenseをダブルクリック→Volumeを30ulにする→OK
13. 下のDispenseをダブルクリック→Volumeを30ulにする→OK
14. Samplesタブ→測定するWellをGray、2、3で選択する→By Rowsにチェック→OK
15. 2のチューブをFirefly Luciferase試薬に、3のチューブをRenilla Luciferase試薬に浸す→Instrument→Prime (1.2ml必要)→Injector 2とInjector 3にチェック→Next→Next
16. Plate IDにFile Nameを入力→Start→プレートをセット→OK
17. Export→Matrix Export Driver→Browse→OK→OK→USBにコピー
18. Instrument→Unload Plate→プレートを回収→Instrument→Load Plate
19. Instrument→Unload Injector→Next (試薬を回収)
20. 70%EtOHをセット→Instrument→Wash→Wash cycleを48にする→Next→Next
21. MilliQをセット→Instrument→Wash→Next→Next
22. チューブをMilliQから出す→Instrument→Wash→Next→Next
23. 本体とPCの電源を切る。
24. 余った予約時間をキャンセルする。
25. 余ったFirefly Luciferase試薬、Renilla Luciferase試薬は、パラフィルムを巻き、縦置きにして-30℃に保存する。
GLOMAX (Promega)を使用する場合
10. GLOMAX (Promega)とパソコンを起動
11. GLOMAXのアプリケーションを起動し、Protocolを開く
12. Optionをクリック→Plate Setupをクリック→測定するウェルを指定
13. Other Optionsをクリック→injection#1をクリック→injection volume 30ul、delay
between injection and measurement 0.4sec、integration time 10secに設定
14 injection#2をクリック→injcetion volume 30ul、delay between injection and
measurement 0.4sec、integration time 10secに設定し、Apply Changesをクリック
15. 2本のチューブを、2本のMilliQの入り50mlチューブに浸し、Flushをクリック→both
injectorsをクリック→Flushをクリック
16. 左のチューブをLuc試薬に、右のチューブをRenilla試薬に浸し、injectorの先を取り外して手で持ち、waste
trayの上で保持する
17. Primeをクリック→both injectorsをクリック→Primeをクリック
18. 96wellプレートをセットし、START
19. 測定終了後、2本のチューブを2本の70%エタノール入り50mlチューブに浸し、Flushをクリック→both
injectorsをクリック→Flushをクリック
20. 2本のチューブを2本のMilliQ入り50mlチューブに浸し、Flushをクリック→both
injectorsをクリック→Flushをクリック
21. 2本のチューブをMilliQから出し、Flushをクリック→both injectorsをクリック→Flushをクリック
22. waste trayの廃液を捨てる
23. 余ったLuc試薬、Renilla試薬は-30℃に、白色96wellプレートは水で洗って再利用する
Cat promoter、Fabp4 promoterのルシフェラーゼアッセイ