組織TBARS測定

1. 凍結した組織を約40-70mg測り取り、1.5mlチューブに入れ、液体窒素に浸ける。
2. 氷冷した組織破砕液を10ul/mg tissue weightの割合で加え、on ice。
3. Sonifier 450 (Branson), output 3で破砕する。
4. 800g, ４℃, 10minで遠心し、中間層300ulを回収し、on ice。
5. 800g, ４℃, 10minで遠心し、中間層200ulを回収し、on ice。
6. 800g, 4℃, 10minで遠心し、中間層100ulを回収し、on ice。
7. TBA溶液を調整しておく(溶けにくい)。
8. 6M 1,1,3,3-Tetramethoxypropane (MDA) (Sigma, 108383)を1M Tris-HCl (pH 7.8)で希釈して4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0uMに調製し、200ulを分注してstandardとする。
9. 1M Tris-HCl (pH 7.8) 190ulに手順5で回収したサンプル10ulを加える
10. standard、サンプルにBHT溶液2.5ulを加える。
11.TBA溶液50ulを加え、vortex。
12. 95℃, 60minインキュベート(蓋が開かないように重りを乗せておく)。
13. on iceにし、1-Butanol (nacalai, 06016-85) 250ulを加え、vortex 15sec。
14. 3000g, R.T., 10minで遠心。
15. 上清100ulをblack plate (Thermo)に移す。
16. 蛍光プレートリーダーを用いて、励起515nm/測定553nmで測定する。
17. 原液を用いて蛋白定量し、補正する。