カタラーゼ活性測定

Catalase Assay Kit (Cayman, 707002)を使用する場合

1. 凍結した組織を約30-60mg測り取り、2ml平底チューブ(Thermo, 339652)に入れ、液体窒素に浸ける。
2. 氷冷した組織破砕液を10ul/mg tissue weightの割合で加え、on ice。
3. Sonifier 450 (Branson), output 3で破砕する。
4. 10000g, ４℃, 15minで遠心し、中間層200ulを回収し、on ice。
5. 10000g, ４℃, 5minで遠心し、中間層を回収し、on ice (液体窒素で保存可)
6. 4.25mM formaldehydeを調製する。
7. 1.5mlチューブに4.25mM formaldehydeを0, 10, 30, 60, 90, 120, 150ul加え、sample bufferで1000ulにメスアップし、standardとする。
8. Catalase希釈液を調製する。
9. 手順5で回収したサンプルをsample bufferで8倍希釈する。
10. 96ウェルプレート(Iwaki, 3860-096)にassay buffer 100ul、メタノール30ulを加える。
11. standard、catalase希釈液、希釈サンプルを20ul加える。
12. H2O2希釈液を調製する。
13. H2O2希釈液20ulをウェルに加え、マルチチャネルでピペッティングし、室温でインキュベート20min。
14. 10M KOH 30ulを加え、Purpald (Cayman, 707017) 30ulを加え、マルチチャネルでピペッティングし、室温でインキュベート10min。
15. Potassium Periodate (Cayman, 707018) 10ulを加え、マルチチャネルでピペッティングし、室温でインキュベート5min。(細かい泡が生じる)
16. 細かい泡を吸わないように、150ulを新しいウェルに移し、O.D. 540nmを測定する。
17. 手順5で回収したサンプルを希釈せずに蛋白定量し、補正する。