細胞内8-isoprostane測定

8-Isoprostane EIA Kit (Cayman, 516351)を使用する場合

1. 細胞(6 well)をPBS 1mlで2回wash (液体窒素→-80℃で保存可)。
2. 氷冷した組織破砕液500ulを加え、スクレイパーで1.5ml チューブに回収し、on ice。
3. Sonifier 450 (Branson), output 3で破砕する。
4. 3倍希釈し、蛋白定量を行う。

抽出効率を算出する場合
5. 全てのサンプルから一部を分注して一旦合わせ、300ul x 2本に分注する。
6. 一方にのみ5ng/ml 8-isoprostane 12ulを加える。

7. サンプルを300ulずつ分注する。
8. 15% KOH 300ulを加え、時々転倒混和しながら40℃, 1hr。
9. 1M リン酸二水素カリウム 693ul、1M リン酸水素二カリウム1107ulを加える。
10. エタノール7.2mlを加え、vortex。
11. 1500g, 10min, R.T.で遠心し、上層を15mlチューブに移す(-80℃で保存可)。
12. 濃縮遠心機(Tomy, CC-105)を用い、over nightで溶媒を蒸発させる(-80℃で保存可)。
13. 30%酢酸600ulを加え、vortex。
14. Sep-Pak Vac 3cc (Waters, WAT054945)にメタノール(nacalai, 21915-93) 3mlを加える。
15. 乾燥しない内にMilliQ 3mlを加える。
16. サンプルを加える。
17. MilliQ 3mlを加える。
18. ドラフトに入れ、ヘキサン(nacalai, 17929-11) 3mlを加え、2.5mlシリンジ(Terumo, ss-02Sz)で押しだす。
19. ドラフト内で風乾60-90min。
20. 15mlチューブにカラムをセットし、ドラフト内で酢酸エチル/1%メタノール 3mlを加える(-80℃で保存可)。
21. 濃縮遠心機, over nightで溶媒を蒸発させる。
22. EIA Buffer 1〜2mlを加え、vortex
23. 5ng/ml 8-isoprostaneをEIA Bufferで希釈し、500, 500/3, 500/9, 500/27, 500/81, 500/243, 0pg/mlに調製する。
24. プレートにstripをセットし、stripをナンバリングする。
25. 1well (NSB well)にEIA Buffer 100ulを加える。
26. standard 50ulをwellに加える。
27. サンプルを12000g, 4℃, 2minし、上清50ulをwellに加える。
28. 8-Isoprostane AchE Tracer 50ulを加える。
29. NSB well以外に8-Isoprostane EIA Antiserum 50ulを加え、タッピングし、シールをして4℃, over night。
30. Ellman's Reagentを調製する。
31. Wash Buffer 300ulで5回washする。
32. Ellman's Reagent 200ulを加え、遮光し、R.T., 60-80min
33. O.D. 405nmで測定する。