薬剤誘導性安定発現株作成

1段階感染の場合
1-1. pRetroX-Tightに発現させたい遺伝子を組み込む。
1-2. 手順1で作成したplasmid、pRetroX-Tet-On Advancedを用い、それぞれのレトロウイルスを作成する。
1-3. 標的細胞 10cm dish 1枚にDay1, Day2のレトロウイルスを混ぜた溶液4mlずつを添加する。非感染細胞も2枚用意しておく。
1-4. 10mg/ml polybreneを1/1000量添加する。
1-5. 翌日、puromycin+G418でselectionする。(非感染細胞はpuromycin、G418それぞれ単独でselectionする)
1-6. 3-5日間、継代しながらselectionを続ける(感染効率はほぼ100%)。

2段階感染の場合
1-1. pRetroX-Tet-On Advancedを用いてレトロウイルスを作成し、細胞に感染させる。
1-2. pRetroX-Tightに発現させたい遺伝子を組み込み、レトロウイルスを作成し、操作1で樹立した細胞に感染させる。

2-1. 非感染細胞が死滅したら、G418 200ug/ml、puromycin 0.25ug/mlで培養する。
2-2. メディウムで10mg/ml Doxycyclineを希釈し、添加する(直接添加すると凝集する)。