〇核タンパク抽出　HEK293T

1. 10cm dish 4枚をtrypsin/EDTA処理し、セルバンカー3mlを加えて15mlチューブに移し、-80℃に保存。
2. 氷、液体窒素を準備し、遠心機を4℃にする。
3. 細胞を37℃で解凍し、700g, 4℃, 5minで遠心。
4. PBS 1mlを加えてピペッティングし、100ulと900ulに分けて1.5mlチューブに移し、on ice。
5. 700g, 4℃, 5minで遠心し、上清を除き、100ulを分注した方は液体窒素につける。
6. 900ul分注した方に、冷やしたBuffer A 1mlを加え、ピペッティングし、700g, 4℃, 5minで遠心。
7. 上清を除き、冷やしたBuffer A 1mlを加えピペッティングし700g, 4℃, 5minで遠心。
8. 上清を除き、冷やしたBuffer A 500ulを加え、1ml douce homogenizer (Active Motif, 40401), Looseで50回ダウンスし、1.5mlチューブに回収。
9. dounce homogenizerにBuffer A 500ulを加えて共洗いし、1.5mlチューブに回収。
10. 10ulを分取し、トリパンブルーで脱核していることを確認。
11. 2200g, 4℃, 5minで遠心し、上清を除く。
12. Buffer A 1mlを加え、2200g, 4℃, 5minで遠心し、上清を除き、ペレット量を見積もる。
13. Buffer Cをペレット量の1.5倍加え、ピペッティング。
14. 総量の1/12の4M NaClを、タッピングしながら少しずつ加える。
15. dounce homogenizer, Looseで3回ダウンスし、1.5mlチューブに戻し、rotate, 4℃, 15min。
16. 12000g, 4℃, 30minし、上清を1.5mlチューブに回収。
17. 4xサンプルバッファーを加え、95℃, 5min。
18. 手順5で液体窒素につけたサンプルに、1xサンプルバッファー160ulを加え、sonicationし、95℃, 5min。