肝臓グリコーゲン含量測定

Glycogen Assay Kit (Cayman, 700480)を使用する場合

1. 凍結した肝臓40-68mgを量り取り、重量を記録し、1.5ml pellet pestles (Kontes, 749520-0000)付属のチューブに入れ、液体窒素に浸ける。
2. on iceにし、Glycogen Assay Bufferを5ul/mg tissue量加え、1.5ml pellet pestlesで破砕する。
3. Sonicationをかけ、DNA測定用に30ulを分注する(-30℃に保存可)。
4. 残りを800g, 4℃, 10minで遠心し、上清100ulを回収する(-80℃に保存可)。
5. 100℃, 5minでインキュベートし、12000g, 4℃, 5minで遠心し、上清40ulを回収し、on ice。
6. Glycogen Assay Bufferで300倍希釈し、on ice。
7. 2mg/ml glycogenをGlycogen Assay Bufferで希釈し、40, 30, 20, 15, 10, 5, 2.5, 0ug/mlのstandardを調製する。
8. Hydrolysis enzyme solutionを調製する。

節約法(23サンプル以上の場合)
9. 96well black plateにstandard 7ulを加える。
10. 手順6で調製した希釈サンプル7ulを2wellに加える(sample wellとbackground well)
11. standard wellとsample wellに、hydrolysis enzyme solution 35ulを加える。
12. background wellに、Glycogen Hydrolysis Buffer (Cayman, 700484) 35ulを加える。
13. 37℃, 30minでインキュベート。
14. Developerを調製する。
15. Developer 105ulを加え、37℃, 15minでインキュベート
16. excitation 535nm/emission 590nmで測定する。
17. standardの蛍光強度から検量線(一次曲線)を算出する。
18. sample wellからbackground wellの蛍光強度を引き、手順6の希釈サンプルglycogen濃度を算出する(ug/ml)。
19. 300を掛け、手順5のサンプルglycogen濃度を算出する(ug/ul)。
20. 5を掛け、臓器中glycogen濃度を算出する(ug/mg tissue)。
21. 手順3で分注したサンプルを500倍希釈し、DNAを測定する(ug/mg tissue)
22. 手順20の値を手順21の値で割る(ug/ug DNA)。

通常法(22サンプル以内の場合)
9. 96well plateにstandard 10ulを加える。
10. 手順6で調製した希釈サンプル10ulを2wellに加える(sample wellとbackground well)
11. standard wellとsample wellに、hydrolysis enzyme solution 50ulを加える。
12. background wellに、Glycogen Hydrolysis Buffer (Cayman, 700484) 50ulを加える。
13. 37℃, 30minでインキュベート。
14. Developerを調製する。
15. Developer 150ulを加え、37℃, 15minでインキュベート
16. excitation 535nm/emission 590nmで測定