SOD活性測定

Superoxide Dismutase Assay Kit (Cayman, 706002)を使用する場合

1. 凍結した組織を約30-60mg測り取り、2ml平底チューブ(Thermo, 339652)に入れ、液体窒素に浸ける。
2. 氷冷した組織破砕液を10ul/mg tissue weightの割合で加え、on ice。
3. Sonifier 450 (Branson), output 3で破砕する。
4. 10000g, ４℃, 15minで遠心し、中間層200ulを回収し、on ice。
5. 10000g, ４℃, 5minで遠心し、中間層を回収し、on ice (-30℃で保存可)
6. SOD stock solution 0, 20, 40, 80, 120, 160, 200ulを1.5mlチューブに入れ、Sample Bufferで1mlにメスアップし、standardとする。
7. 手順5で回収したサンプルをSample Bufferで8倍希釈する。
8. Radical Detector (Cayman, 706004) 25ulをAssay Buffer 9975ulで希釈し、遮光する。
9. Xanthine Oxidase (Cayman, 706006) 25ulをSample Buffer 975ulで希釈する。Xanthine Oxidase原液は4℃に保存する。
10. 96 well plate (Iwaki, 3860-096)にstandard、希釈したサンプル10ulを加える
11. Radical Detector希釈液 200ulを加える。
12. Xanthine Oxidase希釈液 20ulを加え、マルチチャネルでピペッティングする。
13. 室温で20分インキュベートし、O.D. 450nmで測定
14. 手順5で回収したサンプルを希釈せずに蛋白定量し、補正する。