〇タグ付き蛋白の免疫沈降後溶出

サンプルバッファーで溶出する場合：ビーズについたIgGも溶出される
1. 1xサンプルバッファー40-60ulを加え、インキュベート95℃, 5min (-30℃に保存可)

FLAG peptideで溶出する場合：FLAG蛋白のみ溶出される
1. 200ug/ml FLAG peptideを調製する。
2. ビーズに200ug/ml FLAG peptide 20-30ulを加え、室温で時々タッピング or Micro mixer (TAITEC, E-36)で10-15min。
3. 遠心1000g, 4℃, 30sec-1minし、手順2で加えた量と同量の上清を回収し、ビーズに200ug/ml FLAG peptide 20-30ulを加え、室温で時々タッピング or Micro mixerで10-15min。
4. 遠心1000g, 4℃, 1minし上清を回収し、手順3で得た溶液と合わせる。
5. Micro Bio-Spin Chromatography Columns (BioRad, 732-6204)を1.5mlチューブにセット or Ultrafree-MC (Millipore, UFC30SV00)を準備する。
6. 溶液を加え、1000g, 4℃, 1minで遠心。
7. サンプルバッファーを加え、インキュベート95℃, 5min (-30℃に保存可)。

LC-MS/MSにかける場合
1. Elute Buffer 500ulを加え、タッピングし、遠心1000g, 1min, 4℃し、26Gアスピレーターでアスピレート。
2. 手順7をさらに2回繰り返す。
3. ビーズに200ug/ml FLAG peptide 30ulを加え、時々タッピングしながら室温で15min。
4. 1000g, 4℃, 1minして上清を回収し、ビーズに200ug/ml FLAG peptide 30ulを加え、時々タッピングしながら室温で15min。
5. 上清を回収し、手順4で得た溶液と合わせる。
6. Micro Bio-Spin Chromatography Columns (BioRad, 732-6204)を1.5mlチューブにセットする。
7. 溶液を加え、1000g, 4℃, 1min
8. 20ulをLC-MS/MS用に分注し、残りをWestern用にする(-80℃に保存可)。