〇ウェスタンブロット

抗体の保存温度

1. トランスファーバッファーを調製し、メンブレンと濾紙の在庫を確認する。
2. SDS-PAGEが終了したら、トランスファー装置を発泡スチロールに入れ、周りを氷水で囲む。
3. Immobilon-P (Millipore, IPVH304F0/IPVH00010) or Immun-Blot PVDF (BioRad, 1620177) (7cm x 9cm)に裏表が分かるように印をつけ、メタノールに浸す。
4. メンブレンをトランスファーバッファーに浸す。
5. カセットの+極側を下にし、トランスファーバッファーに浸け、下からスポン ジ、ろ紙 (Whatman, 3030917) (8cm x 10cm)を乗せる。
6. ゲル板を超純水で洗ってから開き、、ゲルとゲル板の間を剃刀で切る。
7. ウェルの少し下を剃刀で切り、ペーパータオルをくっつけ、剥がして除く。
8. メンブレンをゲルの上に乗せる。
9. ひっくり返し、メンブレンとゲルをくっつけたまま濾紙の上に乗せる。
10. ゲルの上にろ紙とスポンジを乗せ、カセットを閉じ、トランスファー装置にセットする。
11. 装置にトランスファーバッファーを満たし、余ったトランスファーバッファーをガラス瓶に保管する。
12. パワーサプライに接続し、250mA, 2.5-3hr。装置が複数ある時は、一つずつパワーサプライに接続し、正常に通電するかチェックしておく。(終了後、室温over nightで放置可。さらにトランスファーバッファーに浸し、4℃で保存可)
13. 0.1%TBSTと3% skim milkを調製する
14. メンブレンを回収し、余分な部分を切る
15. 0.1%TBSTにつけて少し洗う
16. 3% skim milkに浸け、室温, 40min〜4hrでorbital shake。
17. 一次抗体を3% skim milk or Can Get Signal Solution 1 or Can Get Signal Solution 2 (標識抗体の場合)で希釈する。

一次抗体反応時間が短い場合
18. パラフィルムの上に、メンブレンを表を上にして置き、一次抗体希釈液を約3mlかける。
19. パラフィルムに皺がある所は、ピンセットで押して台に留める。
20. 室温で60min-3hrインキュベート。

一次抗体反応時間が長い場合
18. メンブレンをハイブリバッグに入れる。Can Get Signalの場合は、0.1% TBSTで15min→5min→5min洗浄。
19. 一次抗体希釈液3-5mlを入れてシールする。
20. 縦回転のrotatorにテープで張り付け、4℃, 5hr〜over night
21. CCDカメラを予約する。

二次抗体を使用する場合
22. 0.1% TBSTに浸し、室温でrotate, 5min。これを計3回繰り返す。(一次抗体が異なるメンブレンは別々の容器で行う)
23. 二次抗体を3% skim milk or Can Get Signal Solution 2で希釈する
24. パラフィルムの上に、メンブレンを表を上にして置き、二次抗体希釈液2-3mlをかける。
25. パラフィルムの周りをピンセットで押し、台に留め、タッパー等をかぶせておく。
26. 室温で40-80minインキュベート。
27. 0.1% TBSTに浸し、室温でrotate, 5min。これを計3回繰り返す。(一次抗体が異なるメンブレンは別々の容器で行う)
28. 発光する。
29. 検出する。

HRP付き一次抗体を用いる場合
21. 0.1% TBSTに浸し、室温でrotate, 5min。これを計3回繰り返す(一次抗体が異なるメンブレンは別々の容器で行う)。
22. 発光する。
23. 検出する。