〇VIKING法

1. CHOPCHOPを用い、exon 2の中でRankが最も高い標的配列を選択する。
2. 以下のoligoを注文する。
　・標的配列がGから始まる場合：CACC-「標的配列」、AAAC-「標的配列のreverse complement」
　　例：GTGGAGTCCTGGAGGACAGA-TGGの場合は、CACC-GTGGAGTCCTGGAGGACAGAと、AAAC-TCTGTCCTCCAGGACTCCAC
　・標的配列がG以外から始まる場合：CACCG-「標的配列」と、AAAC-「標的配列のreverse complement」-C
　　例：ATGGAGTCCTGGAGGACAGA-TGGの場合は、CACCG-ATGGAGTCCTGGAGGACAGAと、AAAC- TCTGTCCTCCAGGACTCCAT-C
3. pX330をBbsI-HFで切断し、oligoをligationする。
4. CHO細胞にトランスフェクションする。
5. puromycinでselectionする。
6. 96ウェルプレートに1細胞/wellで限界希釈する。
　・例：9x10^5/ml→100ulを7.5mlに希釈(1.2x10^4/ml)→10ulを12mlに希釈(10/ml)→100ulずつ播種
　・限界希釈した溶液はピペッターではなく振とうで撹拌する。ピペッターに細胞がくっつく可能性がある
7. 2-3日毎に培地交換する(培地は少し残してアスピレートする)。
8. single colonyを形成しているウェルを同定する(対物レンズ4倍+10-40倍用絞りにすると良く見える)。
9. 32ウェルを、Trypsin-EDTA 50ulを使用し、12ウェルプレートに継代する。
　・15mlチューブに培地を1ml入れておく。
　・PBS 100ulでwash→Trypsin-EDTA 50ulを加える→培地100ulを加える
10. 半分をDNA抽出用に6ウェルに継代し、残りを凍結保存する。
11. ゲノム抽出する。