8-isoprostane測定

8-Isoprostane EIA Kit (Cayman, 516351)を使用

凍結組織の場合
1-1. 凍結した組織を氷上で約27-70mg測り取り、重量を記録し、1.5mlチューブに入れ、液体窒素に浸ける(-80℃に保存可)。
1-2. on iceにし、一度ふたを開けて空気を抜き、氷冷した組織破砕液を10ul/mg tissue weightの割合で加える。
1-3. Sonifier 450 (Branson), output 3で破砕する(-80℃に保存可)。
1-4. 室温に戻し、200-280ulを1.5mlチューブに分注し、4℃。
1-5. 残りの一部を2倍希釈して蛋白定量を行う。もしくはDNA濃度測定を行う(脂肪組織は20-40倍希釈)。

分画細胞の場合
1-1. 脂肪細胞とSVCを分画する。
1-2. 細胞をon iceにし、氷冷した組織破砕液を200ul加える。
1-3. Sonifier 450 (Branson), output 3で破砕する(-80℃に保存可)。
1-4. 一部を用いてDNA濃度測定を行う(脂肪細胞分画は10倍希釈。SVCは100倍希釈)。

抽出効率を算出する場合
2-1. サンプルと同量の抽出効率算出用サンプルを2本作成する。
2-2. 抽出効率算出用サンプルの一方にのみ5ng/ml 8-isoprostane 1/25量を加える。

2-3. 15% KOHをサンプル量の等量加え、時々転倒混和しながら40℃, 1hr (-30℃に保存可)。
2-4. 15mlチューブに移し、1M potassium phosphate buffer (pH 7.0)を手順2-3のサンプル量の6倍量加える(-80℃に保存可)。
2-5. エタノール(nacalai, 14713-95)を手順2-3のサンプル量の24倍量加え、vortex。
2-6. 1500g, R.T., 10minで遠心し、上層を15mlチューブに移す(-80℃に保存可)。
2-7. 濃縮遠心機(Tomy, CC-105)にセットし、Heat OFF, Rotor COMP, Air OFFで溶媒を蒸発させる(最大18サンプル)(4℃に保存可)。使用後はローターを取り外す。
2-8. ドラフト内で、30%酢酸 400ulを加え、vortex。
2-9. Sep-Pak Vac 3cc (Waters, WAT054945)にメタノール(nacalai, 21915-93) 3mlを加える。
2-10. MilliQ 3mlを加える。
2-11. ドラフト内で、サンプルを加える。
2-12. MilliQ 3mlを加える。
2-13. ドラフトに入れ、ヘキサン(nacalai, 17929-11) 3mlを加え、2.5mlシリンジ(Terumo, ss-02Sz)で押し出す。
2-14. ドラフトに入れ、1hr以上風乾させる。
2-15. 15mlチューブにカラムをセットし、ドラフトの中で酢酸エチル/1%メタノール 3mlを加える(4℃に保存可)。終了したカラムは、ドラフト内で乾燥させてから廃棄する。
2-16. 500ulを1.5mlチューブに分注し、Genevac EZ-2 Plusに移動する。
2-17. 電源ON→LID→アダプターとサンプルをセット→蓋を閉める→SET MAX TempをLAMP offに設定。
2-18. Selectダイヤルを回し、Low BP→Time to Final Stageを1hrに変更→Final Stage Timeを0minに変更→Start。
2-19. 終了したら、廃液を捨て、サンプルを回収する(4℃に保存可)。
2-20. ELISA Bufferを、100-1000ul (分画細胞は500ul)加え、 vortex (-80℃で保存可)。
2-21. 5ng/ml 8-isoprostaneを調製し、EIA Bufferで希釈し、7段階のstandardを調製する(500, 500/3, 500/9, 500/27, 500/81, 500/243, 0pg/ml) (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0pg/ml) (320, 160, 80, 40, 20, 10, 0pg/ml)
2-22. プレートにstripをセットし、stripをナンバリングする。
2-23. 1well (NSB well)にEIA Buffer 100ulを加える。
2-24. standard 50ulをwellに加える。
2-25. サンプルを12000g, 4℃, 1-5minし、上清50ulをwellに加える。
2-26. 8-Isoprostane AchE Tracer (赤色) 50ulを加える。
2-27. NSB well以外に8-Isoprostane EIA Antiserum (青色) 50ulを加え、タッピングしてシールし、4℃, over night
2-28. Ellman's Reagentを調製する。
2-29. マルチチャネル(RAININ)にチップ(RAININ, RT-L1200)を付け、Wash Buffer 300ulで5回washする。
2-30. Ellman's Reagent 200ulを加え、遮光し、R.T., 60-90min
2-31. O.D. 405nmを測定する。
2-32. 各O.D.から、NSBのO.D.を引く(ΔO.D.)。
2-33. 各ΔO.D.を、0pg/mlのΔO.D.で割り、100を掛ける(%B/B0)。
2-34. %B/B0をx軸に、standardの濃度のlog10した値をy軸に散布図を作成し、三次曲線で近似曲線を算出する。
2-35. 近似曲線から逆算した値を10にべき乗し、手順2-20の溶液濃度(pg/ml)を算出する。
2-36. 手順2-20で加えた液量から、手順2-15の濃度(pg/ml)を算出する。
2-37. 3(ml)を掛け算し、手順2-3のサンプル内の重量(pg)を算出する。
2-38. 手順2-3のサンプル量から、手順2-3のサンプル濃度を(pg/ml)を算出する。
2-39. DNA濃度(ug/ml)で割り算し、DNA当りの重量(pg/ugDNA)を算出する。
2-40. (抽出効率を算出している場合は)抽出効率で補正する。