〇CRISPR-Cas9　プラスミド作成　indel変異

1. CACCG-標的配列と、AAAC-[標的配列のreverse complement]-Cの配列を持つoligonucleotideを購入する。
　例：
　　・GTGGAGTCCTGGAGGACAGA-TGGの場合は、CACCG-GTGGAGTCCTGGAGGACAGAと、AAAC- TCTGTCCTCCAGGACTCCAC-C
　　・CCG-AGATGTGCGAACTGGACACAの場合は、CACCG-TGTGTCCAGTTCGCACATCTと、AAAC- AGATGTGCGAACTGGACACA-C

lentiCRISPRv2を使用する場合
2. lentiCRISPRv2 2ulを、Esp3Iで切断し、CIAP処理する。
3. ゲル切り出しをし、2kbのバンドを除く。
4. oligoを挿入する。

PX458/PX459を使用する場合
2. PX459 2ugを、BbsI (-80℃保存)で、40ulの系、over nightで制限酵 素処理する。
3. CIAP (TaKaRa, 2250A) 1ulを加え、37℃, 30min (-30℃で保存)。
4. カラム精製する。
5. oligonucleotideをリン酸化/アニーリングす る。
6. 手順9のPX459と手順10のoligoを1：1でライゲーション、transformationする。
7. small culture、mini prepし、U6-Fwd primer (GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC)でシークエンスする。