薬剤誘導性安定二重発現株作成

薬剤誘導性発現株(G418/Puromycin耐性)が既にある場合
1. pRetroX-Tight-Hygに目的遺伝子を組み込み、Maxi prepする。
2. 抗生物質(-)のPlatEを10cm dish 1枚用意する。
3. G418/Puromycin耐性株を起こす。
4. 手順1でMaxi prepしたプラスミドを、Plat Eにlipofectamine 3000を用いてトランスフェクションする。
5. 翌日(Day1)に培地交換を行い、培地を回収し、フィルターで濾過し、4℃に保存する。
6. G418/Puromycin耐性株を10cm dish 7枚に継代する。
7. Day2に培地を回収し、フィルターで濾過する。
8. 手順5で保存したウイルスをG418/Puromycin耐性株10cm 3枚に、手順7で回収したウイルスを10cm 3枚に加える。
9. 全てのdishに10mg/ml polybrene 1/1000量を加える。
10. 翌日、50mg/ml Hygromycin B (nacalai, 09287-84) を終濃度200-400ug/mlとなる様に加える。
11. 非感染細胞が死滅したら、抗生物質の濃度を、G418は200ug/mlに、puromycinは0.25ug/mlに、hygromycinは100ug/mlで培養する。

三重感染させる場合
1. pRetroX-Tight-PurとpRetroX-Tight-Hygに目的遺伝子を組み込む。
2. PlatEを6cm dish 3枚用意する。
3. 手順1で作成したプラスミド2.5ugずつを、PlatE 6cm dish 1枚に、lipofectamine 3000を用いてトランスフェクションする。
4. pRetroX-Tight-PurとpRetroX-Tight-Hyg 2.5ugずつを、PlatE 6cm dish 1枚に、lipofectamine 3000を用いてトランスフェクションする。
5. pRetroX-Tet-On Advanced 5ugを、PlatE 6cm dish 1枚に、lipofectamine 3000を用いてトランスフェクションする。
6. 翌日(Day1)に培地交換を行い、培地を回収する。回収した培地はフィルターで濾過し、4℃に保存する。
7. 感染させる細胞を10cm dish 11枚用意する。
8. Day2 (やむを得ない場合はDay3)に培地を回収する。回収した培地はフィルターで濾過する。
9. 手順7で用意した細胞2枚を培地交換し、遺伝子を組み込んだpRetroX-Tight-Pur由来ウイルス(Day1)全量、遺伝子を組み込んだ pRetroX-Tight-Hyg由来ウイルス(Day1)全量、pRetroX-Tet-On Advanced由来ウイルス(Day1)半量を加える。
10. 手順7で用意した細胞2枚を培地交換し、pRetroX-Tight-Pur由来ウイルス(Day1)全量、pRetroX-Tight-Hyg由来ウイ ルス(Day1)全量、pRetroX-Tet-On Advanced由来ウイルス(Day1)半量を加える。
11. 手順7で用意した細胞2枚を培地交換し、遺伝子を組み込んだpRetroX-Tight-Pur由来ウイルス(Day2-3)全量、遺伝子を組み込んだpRetroX- Tight-Hyg由来ウイルス(Day2-3)全量、pRetroX-Tet-On Advanced由来ウイルス(Day2-3)半量を加える。
12. 手順7で用意した細胞2枚を培地交換し、pRetroX-Tight-Pur由来ウイルス(Day2-3)全量、pRetroX-Tight-Hyg由来 ウイルス(Day2-3)全量、pRetroX-Tet-On Advanced由来ウイルス(Day2-3)半量を加える。
13. 細胞11枚全てに10mg/ml polybrene 1/1000量を加える。
14. 24時間後、10cm dishに継代を行い、ウイルス感染細胞に50mg/ml G418 (nacalai, 16513-84) 80ul (終濃度400ug/ml)、1mg/ml puromycin 20ul (終濃度2ug/ml)、50mg/ml Hygromycin B (nacalai, 09287-84) 40ul (終濃度200ug/ml)を加える。非感染細胞には、G418、Puromycin、Hygromycinを同濃度で一種類ずつ添加する。
15. 非感染細胞が死滅したら、対応する抗生物質の濃度を、G418は200ug/mlに、puromycinは0.25ug/mlに、hygromycinは100ug/mlに落とす。