shRNA用plasmid作製

1. shRNA用oligoをデザインし、operonに注文する。(64bpの場合、Sigmaは180円/base、operonは50円/base)
2. shRNA用oligoをリン酸化/アニーリングする(-30℃で保存可能)
3. pSUPER.retro.puro 1ugを、total 40ul/over nightで、BglII/HindIIIでdouble digestする(-30℃で保存可能)
4. 手順3で切断したpSUPER.retro.puroにCIAP (TaKaRa, 2250) 1ulを加え、37℃, 1hr (-30℃で保存可能)
5. 手順4で作成したplasmidを精製する。
6. 手順2で作成したoligonucleotide 2ul、手順5で作成したplasmid 2ulをligationし、transformationする。
7. colonyをMini prepする(収量約10ug)。
8. オリゴ(GGAAGCCTTGGCTTTTG)を用いてシークエンスする。

shRNA用plasmid作成成功率