組織Hydrogen Peroxidase測定

Hydrogen Peroxide Assay Kit (abcam, ab102500)を使用

1. PBS約40mlを50mlチューブに入れ、on ice。
2. H2O2 Assay Buffer、4M PCA、2M KOHをon iceにしておく。
3. 7ml dounce tissue grinder (Wheaton, 357542)をラベルしてon iceにしておく。
4. 冷却遠心機を4℃にしておく。
5. マウスを解剖し、組織を採取し、手順1のPBSに入れる。
6. 約200mgに切り分け、重量測定し、on iceでdounce tissue grinderに入れる。
7. 5倍量のH2O2 Assay Bufferを加え、Looseで20回ダウンス。
8. 1mlを1.5mlチューブに回収し、12000g, 4℃, 5minで遠心。
9. 上清450ulを回収し、50ulを蛋白定量用に分注。
10. 4M PCA 133ulを加え、on iceで5min。
11. 13000g, 4℃, 2minで遠心し、上清300ulを回収する。
12. 2M KOH 172ulを加え、vortexし、pH試験紙でpH 6.5-8である事を確認。
13. 13000g, 4℃, 15minし、上清300ulを回収(-80℃に保存可)。
14. H2O2 standard 10ulに超純水870ulを加え、10mM H2O2とする。
15. 10mM H2O2 10ulに超純水990ulを加え、0.1mM H2O2とする。
16. 0.1mM H2O2 100ulに超純水900ulを加え、10uM H2O2とする。
17. 10uM H2O2 0, 5, 10, 15, 20, 25ulをAssay Buffer 100, 95, 90, 85, 80, 75ulに加え、0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5uM H2O2とする。
18. 1well当り、Assay Buffer 48ul、OxiRed Probe 1ul、HRP 1ulを混ぜたReaction Mixを作成する。
19. black plateにサンプル、検量線50ulを加える。
20. Reaction Mix 50ulを加え、遮光してR.T., 10min。
21. SH-9000Labを起動する→リセット→測定条件作成→励起535nm/測定587nmで測定
22. 得られた値を、533/400倍し、更に472/300倍し、手順9のH2O2濃度を算出する(uM)
23. 手順9で分注したサンプルを、Assay Bufferで2倍希釈し、蛋白定量する。
24. 手順22の値を手順23の値で割り算し、H2O2濃度を算出する(nmol/mg protein)