〇in vivo ユビキチンアッセイ

1. pRK5-HA-Ubをtransfectionした細胞にMG132を処理する。
2. PBSで細胞を回収する(液体窒素→-80℃で保存可)。
3. 先切れチップで、室温のユビキチンアッセイ用Lysis Buffer 400-500ulを加え、95℃, 10minし、on ice。
4. Output 3でsonication 10回(-30℃に保存可)。
5. 30ulをinput用に分注し、4xサンプルバッファー 10ulを加え、95℃ 5min (-30℃に保存可)(液が黄色い場合は、1M Tris-HCl (pH 7.8)を1/50量加える)。
6. anti-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma, A2220) 20ulをユビキチンアッセイ用Dilution Bufferで洗浄する。
7. 15mlチューブに、冷やしたユビキチンアッセイ用Dilution Bufferをサンプルの8倍量加え、Protease Inhibitor Cocktail (Nacalai, 25955-11)を9/800量加える。
8. サンプルを室温にしてSDSを溶かし、Dilution Bufferに加える。
9. anti-FLAG M2 Affinity Gelを加え、rotate, 4℃, 60-90min。
10. 溶出の準備をしておく。
11. 遠心1000g, 4℃, 1minし、先切れチップで上清を捨て、1.5mlチューブに移す。
12. 遠心1000g, 4℃, 1minし、26G針でアスピレート。
13. ユビキチンアッセイ用Dilution Buffer 500ulで4回washし、FLAG peptide 40ulで溶出する。