10cm dish 10枚からの核蛋白抽出

1. PBS 5mlでwashし、trypsin/EDTA 1mlを加え、DMEM/10%FBS 4mlで中和し、50mlチューブに回収し、on ice。
2. ペトリディッシュ上で細胞10ulにトリパンブルー10ulを加え、チップの先で広げ、状態を確認する。
3. 400g, 4℃, 5min遠心し、上清をピペッターで捨て、冷やしたPBS(Aprotinin/Leupeptin/PMSF+) 10mlを加え、15mlチューブに移す。
4. 400g, 4℃, 5min遠心し、上清をピペッターで捨て、冷したPBS(Aprotinin/Leupeptin/PMSF+) 10mlを加える。
5. 400g, 4℃, 5min遠心し、上清をピペッターで捨てる。
6. 冷やしたBuffer A 4mlを加え、穏やかに転倒混和し、トリパンブルー染色。
7. 400g, 4℃, 5min遠心し、上清を捨て、冷やしたBuffer Aを加え、穏やかに転倒混和し、トリパンブルー染色。
8. 7ml dounce tissue grinder (Wheaton, 357542)のLooseでダウンス150回し、トリパンブルー染色で核が脱出している事を確認。
9. Buffer A 6ml共洗いして15mlチューブに移し、2150g, 4℃, 5min遠心し、上清をピペッターで捨てる。
10. 冷やしたBuffer A 10mlを加え、2150g, R.T., 5min遠心し、上清を捨て、ペレット量を測定する。
11. Buffer Cをペレット量の1.5倍量加え、低温室に移動し、10mmスターラーバー(アズワン, 1-4206-01)を入れた10mlビーカーに移す。
12. 4M NaCl 1/12量をピペットマンで3ulずつ加える。
13. 7ml dounce tissue grinder (Wheaton, 357542)をLooseでダウンス3回し、ビーカーに戻し、スターラー30min。
14. 20400g, 4℃, 60minし、中間層を回収。
15. 20400g, 4℃, 10minし、中間層を回収。
16. セルロースチューブ(エーディア, UC8-32-25)を切り、超純水500mlを入れた500mlビンに入れ、レンジで沸騰させて30min。
17. 1mM EDTAに交換し、沸騰30min。
18. 超純水に交換し、沸騰30min。
19. セルロースチューブに結び目を3箇所作り、サンプルを入れ、結び目を3箇所作り、Buffer D 500mlに浸け、両端をクリップで止め、スターラー1hr。
20. Buffer Dを交換し、スターラーO/N。
21. 中身を15mlチューブに移した後、1.5mlチューブに移し、20400g, 4℃, 30min遠心し、上清を回収する。
22. 重量を測定し、溶液量を見積もる。
23. Buffer Dで5倍希釈し、蛋白定量する。