15cm dish 30枚からの核蛋白抽出

3T3-L1 15cm dish 45枚の培養に必要な物品
・15cm dish 45枚
・培地 5L
・PBS 2.5L
・50mg/ml G418 20ml
・1mg/ml puromycin 1ml
・セルバンカー 100ml
・trypsin/EDTA 100ml
・10mg/ml Doxycycline 900ul

1. 培地25ml/15cm dishで培養する。
2. PBS 10mlでwashし、trypsin/EDTA 2mlを加え、DMEM/10%FBS 8mlで中和し、50mlチューブに回収する。
3. セルバンカーを、15cm dish 10枚当り20ml加え、-80℃に保存(保存中にチューブが破損しないよう気を付ける)。
4. セルロースチューブ(エーディア, UC8-32-25)を切り、超純水500mlを入れた500mlビンに入れ、オートクレーブ
5. 1mM EDTAに交換し、オートクレーブ
6. 超純水に交換し、オートクレーブ
7. 細胞を解凍し、700g, 4℃, 5minで遠心し、上清をピペッターで捨て、冷やしたPBS(Aprotinin/Leupeptin/PMSF+)を計45ml加え、50mlチューブ1本にまとめ、ピペッティング。
8. ペトリディッシュ上で細胞10ulにトリパンブルー10ulを加え、チップの先で広げ、状態を確認する。
9. 700g, 4℃, 5min遠心し、上清をピペッターで捨て、冷したBuffer A 30mlを加え、ピペッティングし、トリパンブルー
10. 700g, 4℃, 5min遠心し、上清をピペッターで捨て、冷したBuffer A 40mlを加え、ピペッティングし、トリパンブルー
11. 700g, 4℃, 5min遠心し、上清をピペッターで捨て、冷したBuffer A 7mlを加え、ピペッティング。
12. 7ml dounce tissue grinder (Wheaton, 357542)のLooseで50回ダウンスし、トリパンブルー染色で核が脱出している事を確認。
13. Buffer Aで共洗いして50mlチューブに移し、50mlまでメスアップし、2150g, 4℃, 5min遠心し、上清をピペッターで捨てる。
14. 冷やしたBuffer A 10mlを加え、ピペッティングし、15mlチューブに移し、2150g, 4℃, 5min遠心し、上清を捨て、ペレット量を測定する。
15. Buffer Cをペレット量の1.5倍量加え、低温室に移動し、ピペッティングし、スターラーバーを入れた30ml or 50mlビーカーに移す。
16. 総量の1/12の4M NaClを、ピペットマンで10ulずつ加える。
17. 7ml dounce tissue grinderをLooseでダウンス3回し、ビーカーに戻し、スターラー30min。
18. 1.5mlチューブに分注し、20400g, 4℃, 60minし、上清をを15mlチューブに回収。
19. 2150g, 4℃, 10minし、中間層を回収。
20. セルロースチューブに結び目を3箇所作り、ピペットマンでサンプルを入れ、結び目を3箇所作り、Buffer D 1Lに浸け、両端をビニールテープで止め、スターラー1hr。
21. Buffer Dを交換し、スターラーO/N。
22. 中身を15mlチューブに移した後、1.5mlチューブに移し、20400g, 4℃, 30min遠心し、上清を回収する。
23. 溶液量を見積もり、蛋白定量用に40ul分注する(-30℃に保存可)
24. Buffer Dで5倍希釈し、蛋白定量する。