〇cDNAライブラリーから遺伝子をクローニングし、発現プラスミドに入れる

1. プラスミドのmulti cloning siteの内、遺伝子配列に存在しない制限酵素を2つ選択する。候補が複数ある場合は、突出塩基数が多く、double digestionし易い2つを選択する。
2. 遺伝子配列の両端と相同なDNA配列(Tm 63-68℃、末端はCかG)に、必要に応じてKozak配列(GCCACC)、終始コドン、制限酵素配列、A 6個以内(NotIは2個以上)を 付加してプラ イマーを設計し、注文する。
例) NotI配列とKozak配列を付加する場合：AAAAAAGCGGCCGCCACC[相同配列]
3. 5'UTRと3'UTRとの間に、適切なプライマーを設計し、注文する。
4. oligo dTを用いて逆転写したcDNAライブラリー (出来れば組織由来。培養細胞は変異が入っている事がある) 2ulをテンプレートとし、手順2、手順3で注文したプライマーを用い、アニール温度62-65℃/サイクル数35/溶液量50ulでPCRをかけ、電気泳動で増幅を確認する。
5. 手順2のプライマーで満足な増幅が得られなかった場合は、手順3のプライマーで得られた増幅産物に対して手順2のプライマーでnested PCRを行い、電気泳動で増幅を確認する。
6. DNA精製を行い、30ulで溶出(4℃で保存可)
7. 操作6の全量、plasmid 2ugを、Total 40ulの系で制限酵素処理す る。制限酵素の総量は2ul、反応時間は4hr〜over night (-30℃に保存可)
8. plasmidにCIAP (TaKaRa, 2250A) 1ulを加え、37℃で40-100minインキュベート(double digestionの時も行う) (-30℃に保存可)。
9. PCR産物、plasmidをゲル切り出し or DNA精製する(手順4or5における増幅の特異度を見て判断する)。
10. plasmidとPCR産物をライゲーションし、トランスフォーメーションする(plasmidのみのライゲーションも行う (control))。
11. mini prepする。
12. (必要に応じて) cut check。
13. シークエンス