組織カルボニル化蛋白検出

OxyBlot Protein Oxidation Detection Kit (Millipore, S7150)を使用

1. 脂肪組織を約100mg測り取り、1.5mlチューブに入れ、液体窒素につける。
2. 遠心機を冷却しておく。
3. 氷冷したTNE(PI+)を5ul/mg tissue加え、Sonifier 450 (Branson), output 3で破砕し、on ice。
4. 400ulを1.5mlチューブに移し、遠心12000g, 4℃, 10minし、中間層200ulを回収する。
5. 遠心12000g, 4℃, 10minし、中間層1200ulを回収する。
6. 蛋白定量用に20ulを分注し、残りに2-mercaptoethanol (nacalai, 21418-42) 2ulを加える。
7. TNEで10倍希釈し、蛋白定量し、TNE(2ME+)で濃度を揃える(-30℃に保存可)。
8. 1.5mlチューブ2本に5ulずつ分注し、12% SDS 5ulを加える。
9. 片方に1x2,4-Dinitrophenylhydrazine (90448) 10ulを加え、もう片方に1xDerivatization-Control Solution (90463) 10ulを加え、R.T., 15min。
10. Neutralization Solution (90449) 10ulを加える。
11. 4xサンプルバッファー10ulを加え、緑色である事を確認する(4℃に保存可)。
12. サンプルバッファー20ulにMixture of Standard Proteins (90450)(分注して-30℃保存) 2.5ulを加える(4℃に保存可)。
13. Standard Proteinsと一緒にSDS-PAGEをする。
14. トランスファーする。
15. 0.05% PBSTに漬けて少し洗う。
16. 1%BSA/0.05%PBSTに漬け、1時間。
17. パラフィルムの上に、メンブレンの表を上にして置き、抗DNP抗体希釈液3mlをかけ、1時間。
18. 0.05% TBSTに漬け、15min振とう。
19. 0.05% TBSTに漬け、5min振とう。
20. パラフィルムの上に、メンブレンの表を上にして置き、抗ウサギ二次抗体3mlをかけ、1時間。
21. 0.05% TBSTに漬け、15min振とう。
22. 0.05% TBSTに漬け、5min振とう。
23. 発光、検出する。